El Coombs directo se realiza a pacientes en los primeros momentos de una reacción hemolítica y en el diagnóstico de anemias hemolíticas auto inmunes, hemólisis inducidas por drogas, y enfermedad hemolítica del recién nacido. La prueba directa de Coombs (PDC), ya sea con la técnica clásica de aglutinación en tubo o en gel permite identificar la presencia de anticuerpos antieritrocitarios del isotipo IgG.

OBJETIVOS

GENERAL

Comprender la técnica e importancia de la prueba de antiglobulina humana directa, sus funciones y su valor diagnostico en la anemia hemolítica

ESPECIFICO

1. Analizar los resultados de la prueba AGD y correlacionarlos con la sintomatología del paciente

2. Entender los resultados negativos, su comportamiento y el por qué pueden darse

3. Realizar la prueba de AGD, reportar su resultado y correlacionarlo con la patología

COOMB DIRECTO

ANTIGLOBULINA HUMANA DIRECTA

La prueba de Coombs directa detecta anticuerpo(Ac) unidos in vivo en los glóbulos rojos de la sangre. Esta prueba pone en evidencia Ac no aglutinables (tipo IgG) en el suero de los pacientes. Los eritrocitos presentan en su superficie un conjunto de antígenos (Ag), determinados por la herencia de los padres. Los Ag de superficie de los eritrocitos son muchos, pero de los más importantes se encuentran el sistema ABH, el sistema Rh, el D que se encuentra dentro del Rh, el Kell, Duffy y Kidd.

Los Ac pueden unirse a los eritrocitos por varias razones:

A. Producción auto anticuerpos (Auto-Ac) Enfermedades autoinmunes, linfomas y leucemias linfocíticas crónicas en donde el cuerpo crea auto-Ac dirigidos contra las propias células del cuerpo entre esas los eritrocitos.

B. En anemias producidas por fármacos en donde estos inducen la producción de Auto-Ac al depositarse restos de fármacos sobre los eritrocitos. Alguno de los fármacos asociados a la producción de Auto-Ac son la penicilina, cefalosporinas, entre otras administrados por vía intravenosa u oral. En este tipo de situaciones la anemia hemolítica se resuelve al dejar de ingerir el fármaco.

C. Incompatibilidades materno-fetales. En la enfermedad hemolítica del RN en donde la madre produce Ac en contra de los eritrocitos del bebe.

En una transfusión sanguínea el receptor puede generar Ac que se unirán a los glóbulos del donante. Cuantas más transfusiones haya recibido, más fácil es que se presenten anticuerpos frente a los eritrocitos. Cuando el receptor presenta síntomas de una reacción transfusional después de haber recibido sangre se realiza una prueba de Coombs directa para determinar si los Ac se han unido o no a los eritrocitos del donante.

A diferencia de los Acs de clase IgM, cuya estructura pentamérica les permite aglutinar directamente a los eritrocitos, los Acs de clase IgG reaccionan con los hematíes sin llegar a aglutinarlos. El reactivo conocido como suero antiglobulina contiene una anti-inmunoglobulina humana IgG que se une a la porción Fc de las inmunoglobulinas (Igs) IgG estableciendo una conexión entre los diferentes Acs IgG fijados a los hematíes, permitiendo la aparición de la aglutinación deseada, lo que confirma la presencia de Acs no aglutinantes (IgG) en el suero del paciente.

El reactivo de coombs viene en dos presentaciones, el reactivo antiglobulina poliespecífico está constituido por una mezcla de anti-IgG y anticomplemento (anti-C3d y, en algunos casos, anti-C3c), y los reactivos monoespecíficos que en el caso del hemocentro presenta las inmunoglobulinas IgG y las fracciones del complemento C3d y C3d y el control negativo ctl.

Las enfermedades en donde es útil la prueba de coombs directa son: anemia hemolítica autoinmune (AHAI), la enfermedad hemolítica del feto y del recién nacido, las reacciones transfusionales y las anemias hemolíticas inducidas por fármacos.

Cuando se obtiene un resultado positivo en la prueba de antiglobulina directa (AGD) con el reactivo de coombs poliespecifico se debe realizar la prueba fraccionada o prueba con reactivos monoespecíficos para poder conocer el tipo de Ig que se encuentra fijada en los eritrocitos.

Aunque todavía no hay un número mínimo de detección de Ig, se han detectado que usando el reactivo de Anti-Ig se encuentran entre 100-200 moleculas por eritrocitos. Por tal razón se estima que de 25-120 moléculas/globulos rojos conlleva a un resultado negativo, de 120 a 200 se presenta una reacción débil, más de 200 hay una intensidad de positividad de 1+; de 300 a 500 la intensidad es 2+ y más de 500 se puede encontrar una intensidad de 3+ o 4+. Algo muy importante es cuando encontramos positividad tanto en IgG y complemento se debe realizar el control de autoaglutinación incubando los globulos rojos del paiente con solución salina, para así poder asegurar la interpretación correcta de los resultados. Aunque en personas sanas, sin presentar anemia hemolítica, puedan estar presente cerca de 90 molecula de IgG y 40 de Cd3, estos niveles tan bajos no pueden ser detectados por la prueba de AGD.

La correcta interpretación y evaluación de un resultado positivo en la AGD debe tener en cuenta la historia del paciente, su estado clínico y los resultados de otras determinaciones analíticas. Por tanto, se debe tener en cuenta que:

1. Una PDATG positiva aislada no es diagnóstica, se debe tener información sobre el diagnóstico del paciente, la medicación que está recibiendo, sus antecedentes gestaciones y transfusionales y, especialmente, conocer si está anémico o si es portador de una anemia hemolítica adquirida de causa desconocida.

2. Investigación de signos hemolíticos, se debe poner mucha atención a los signos heoliticos que delatan la destruccipon de globulos tojos como lo es la reticulocitosis, esferocitosis, hemoglobinemia, disminución de la haptoglobina, aumento de la bilirrubina indirecta y de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH)

3. Transfusiones recientes. Cuando un paciente ha sido recientemente transfundido, el hallazgo de una AGD positiva puede ser el primer signo de una respuesta inmune frente a los hematíes alogénicos, los cuales pueden aparecer y reaccionar con los eritrocitos de 7-10 días después de la transfusión en el caso de una inmunización primaria.

4. Uso de fármacos, ya que pueden ser los causantes de la AGD

5. Trasplante de progenitores hematopoyéticos o de órganos sólidos ya que muchos linfocitos del donate pueden producir Acs contra las células del receptor

6. Administración de Igs intravenosas IgG (IVIG). Las IVIG pueden contener Acs ABO, anti-D o Acs de otras especificidades que pueden reaccionar con los hematíes del paciente y producir una AGD positiva

Elución del autoanticuerpo

Existen numerosas técnicas para la elución del autoanticuerpo para su estudio. Pero en los últimos años se han impuesto los “kits” comerciales por la sencillez y rapidez del procedimiento. El intenso lavado previo de los hematíes antes de la elución es muy importante para asegurar que el anticuerpo que esperamos encontrar en el eluido es exactamente el que permanecía unido a los hematíes del paciente y que no proviene del plasma del paciente donde puede encontrarse en forma libre. [2] Los Ac de baja afinidad pueden perderse mediante el proceso de elución.

AGD en anemias hemolíticas autoinmunes (AHAI)

La AHAI es una de las causas que pueden producir una anemia hemolítica y nuestro papel en el laboratorio es buscar el tipo de anemia hemolítica producida. Ya al estar establecido la AHAI, la prueba de AGD nos permite definir el tipo de AHAI ya que esto es importante en la manifestación, sintomatología y tratamiento del paciente. Las AHAI pueden producirse por Ac calientes (reaccionan de forma óptima a 37°C) de tipo IgG o Ac fríos y esta última se divide en el síndrome de aglutininas frias y la hemoglobinuria paroxística a frigore, pero muchos pacientes pueden presentar formas mixtas, de allí la importancia del laboratorio en el oportuno y correcto diagnóstico.

AHAI Ac CALIENTES

Los Acs caliente producen una hemólisis de tipo extravascular en el sistema retículo-endotelial. Los hematíes recubiertos de Acs IgG son eliminados de la circulación mediante la unión de la porción Fc del Ac y el receptor para el fragmento Fc de las células fagocíticas y citotóxicas del bazo y, en menor proporción, del hígado.

Si la AGD es positiva por IgG, los autoanticuerpos pueden ser eluidos de la membrana y a continuación se puede examinar su rectividad frente a otros hematíes mediante la prueba de antiglobulina indirecta (AGID). Generalmente, el eluido se comporta como una panaglutinina (reacciona con todo), pero en algunos casos puede mostrar una cierta especificidad relativa, a menudo frente a determinados antígenos del sistema Rh como sucede con el antígeno Rhe (autoanti-e).

AHAI Ac FRÍOS

Las AHAI por Ac fríos son debidas a Acs que reaccionan de forma óptima a bajas temperaturas específicamente a 4ºC. Dentro de este grupo se distinguen dos síndromes: el síndrome por aglutininas frías y la hemoglobinuria paroxística a frigore.

SINDROME POR AGLUTININAS FRÍAS (SAF)

El síndrome por aglutininas frías (SAF) se presenta en un 15% a comparación de las otras AHAI diagnosticadas. Se presenta en mayor proporción en pacientes mayores a los 50 años y de forma rara en niños. Esta presentación se encientra mediada autoanticuerpos de tipo IgM y el grado de anemia va a depender del grado de exposición la frío, la cual puede ser leve o moderada y de manera crónica y vemos en el laboratorio que las muestras presentan autoaglutinación que se asevera cerca de los 4°C y se revierte al calentar la muestra a 37°C y en la prueba de AGD la vemos positiva por anti-C3 y negativa por anti-IgG , ya que aquí predominan son los Ac IgM con gran capacidad de activar complemento llevando a una hemolisis intravascular con una especificidad del Ac frente al Ag del sistema Ii.

HEMOGLOBINURÍA PAROXÍSTICA A FRIGORE

La hemoglobinuria paroxística a frigore es una presentación clínica de muy bajo porcentaje, llegando a ser cerca del 1% de los casos de AHAI y actualmente se encuentra asociada en niños que han sufrido una infección bacteriana o vírica después de 1-2 semanas después del cuadro clínico; los pacientes presentan hemolisis transitorias, no relacionadas con el frio. Los Ac asociados son de tipo IgG pero reaccionan con los globulos rojos generalmente en las zonas frías del cuerpo (extremidades, cara, orejas…) provocando una fijación de C3 que solo se disocia al aumentar la temperatura corporal. Lo que quiere decir que estos Ac se unen en bajas temperaturas y causan hemolisis en altas temperaturas. Generalmente estos Ac tienen especificidad por el Ag P de los eritrocitos, reaccionando con todos los eritrocitos normales a excepción de los de fenotipo excepcional p p Pk.

AHAI MIXTAS

En la AHAI mixta vemos que ambos tipos de anticuerpos (IgG e IgM) coexisten en la etiopatogenia de la anemia. Representa aproximadamente un 10% de los casos de AHAI y se encuentra asociada a pacientes con LES. Podemos ver que hay predominio de signos y síntomas de AHAI por Ac calientes, pero también a temperaturas frias encontramos sintomatología, provocando hemolisis y anemias de inicio brusco, severas y agudas. A diferencia del síndrome por aglutininas frías, los anticuerpos IgM suelen presentar un título ≤ a 64 a 4ºC, pero la amplitud se extiende hasta los 37ºC. La AGD es positiva por IgG y C3, y el eluido contiene el autoanticuerpo IgG esperado.

AHAI CON AGD NEGATIVA

Hay pacientes con características clínicas como hematológicas de una AHAI pero con AGD negativa y se puede deber a

a. Nivel de autoAc fijado a los hematíes está por debajo del nivel de sensibilidad de la técnica de antiglobulina

b. El autoAc fijado a los hematíes es de clase IgM o IgA y no pueden ser reconocidos por el suero antiglobulina

c. AutoAc con baja afinidad que por efecto dosis no es reconocido por el reactivo de antiglobulina

En estos casos hay que recurrir a otras pruebas o técnicas como el lavado de erirocitos con solución salina fría (4°C) o con solución LISS con su debido control de autoaglutinación. Otra alternativa es repetir la AGD con reactivos monoespecíficos de clase IgM e IgA. Otras técnicas usadas con resultados no tan correlacionados pueden ser: la técnica de consumo de complemento en el anticuerpo fijado, la técnica de la antiglobulina enzimática, el radioinmunoensayo con anti-IgG, citometría de flujo, fase sólida, aglutinación directa con PEG o polibrene, aglutinación en targeta, y técnicas de concentración del eluido

PREGUNTAS

1. ¿Utilidad de prueba coombs directo (PCD)?

Diagnóstico de anemias hemolíticas auto inmunes, hemólisis inducidas por drogas, y enfermedad hemolítica del recién nacido

2. Tipos de reactivos en el mercado [2]

3. ¿Qué es elución y para qué sirve?

Liberar los Ac unidos a la membrana del glóbulo rojo proveniente de un proceso de adsorción. Dependiendo de las necesidades y protocolos de trabajo del Banco de Sangre se puede separar el anticuerpo conservando la integridad de la membrana del glóbulo rojo o rompiendo las membranas del eritrocito mediante agentes químicos como el éter, cloroformo, digitonina o mediante condiciones físicas extremas como la congelación o el calor. Una vez liberado el anticuerpo se procede a determinar su especificidad a través del panel de identificación de anticuerpos [3]

Para estas técnicas se hacen modificaciones fisicoquímicas al medio de reacción, de esta manera se realiza la separación de los anticuerpos con sus correspondientes antígenos que se encuentran unidos porenlaces iónicos, puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals y enlaces hidrofóbicos. Este tipo de enlaces no covalentes se pueden romper con las variaciones en el medio, entre las que se encuentran:

a) Cambios de pH: el pH ideal para reacción Ag-Ac es entre 6.5 y 7

b) Temperatura. De manera general, se puede decir que los anticuerpos de tipo IgM reaccionan de forma ideal a temperaturas bajas, entre 4 y 27ºC, mientras que los anticuerpos IgG lo hacen mejor a 37ºC. Esta regla se rompe con algunos anticuerpos que pueden presentar reactividad con su correspondiente antígeno tanto a 4ºC como a 37ºC.

c) Fuerza iónica. Cuando los eritrocitos se encuentran suspendidos en solución salina, los iones de Na+ y Cl- neutralizan parcialmente las cargas opuestas entre el antígeno y el anticuerpo, por lo que el aumento o la disminución de la cantidad de iones en el medio favorece o disocia la reacción antígeno-anticuerpo.

4. Tipos de elución

Existen dos diferentes tipos de elución, para estudiar Ag y para estudiar Ac.

Elución para estudiar antígenos: Cuando los glóbulos rojos se encuentran recubiertos con inmunoglobulinas pueden aglutinarse de forma espontánea, lo que suele dar origen a resultados falsos positivos en su tipificación, en especial cuando se requiere hacer la prueba de D débil o la fenotipificación de ciertos antígenos en las que los eritrocitos deben llevarse hasta la prueba de Coombs. El tipo de elución no debe dañar la membrana eritrocitaria, de tal manera que una vez que hemos hecho el procedimiento, el anticuerpo del eritrocito pueda ser fenotipificado sin riesgo mayor de resultados falsos positivos.

De igual manera, para realizar una autoadsorción (en pacientes que no han sido recientemente transfundidos), y los eritrocitos autólogos tienen un Coombs directo positivo, se requiere hacer este tipo de elución con el fin de dejar la membrana eritrocitaria con sus sitios de unión libres para que se adsorban los autoanticuerpos del suero. De este tipo de elución existen los siguientes métodos:

a) Calor. Se utiliza cuando los eritrocitos están recubiertos por IgG. Los glóbulos rojos deben ser incubados a 45ºC durante 10 min.

b) Difosfato de cloroquina. Para la disociación de IgG de la membrana eritrocitaria. Por la eficacia de este método así como por el volumen de células que se pueden trabajar, es una buena opción para realizar técnicas de autoadsorción aunque también se utiliza para tipificar los diferentes sistemas sanguíneos. Es importante mencionar que los antígenos del sistema Rh, Jka y Jkb pueden expresar cierto debilitamiento o desnaturalización. El tiempo máximo de tratamiento es de dos horas.

c) EDTA-glicina ácida. Es un método rápido para la disociación de IgG. En un tiempo máximo de cinco minutos, los eritrocitos que inicialmente tenían un Coombs directo positivo, pueden usarse para realizar autoadsoción y/o tipificación sanguínea. Por este método se desnaturalizan los antígenos del sistema Kelly, Vg. y Er.

Elución para estudiar anticuerpos.: El objetivo de este tipo de elución es separar los anticuerpos unidos a la membrana eritrocitaria sin que sean dañados, de tal modo que el eluído (también llamado eluato) permita el estudio y así definir cuál es la especificidad del anticuerpo. La membrana puede ser dañada físicamente por calor, ultrasonido, congelamiento-descongelamiento, detergentes o solventes orgánicos; los enlaces de los complejos antígeno-anticuerpo se pueden romper por variaciones en el pH. Al igual que en la elución para estudiar antígenos, existen diferentes métodos de elución para estudiar anticuerpos:

a) Disolventes orgánicos. Este tipo de elución es adecuado para las pruebas de antiglobulina directa positiva por autoanticuerpos o aloanticuerpos calientes (IgG). La temperatura a la que se trabaje la técnica depende del tipo de disolvente orgánico que se utilice y será de 37ºC o 56ºC. A pesar de que estas técnicas de elución son relativamente rápidas (aproximadamente 30 minutos) el resultado final de la identificación de anticuerpos se obtiene en dos horas +/- 20 minutos.

b) Elución ácida o elución EDTA-glicina ácida. Si bien aún no está completamente definido por qué se despegan los anticuerpos a pH bajo, se piensa que se debe a la disociación de uniones electrostáticas en las proteínas y al cambio que sufren éstas en su estructura terciaria. Al igual que con los disolventes orgánicos, éste es un buen método para la recuperación de autoanticuerpos y aloanticuerpos de tipo IgG. El tiempo para obtener el resultado de la especificidad del anticuerpo presente en la muestra estudiada es de aproximadamente 30-40 minutos.

c) Elución por calor. Este tipo de elución se recomienda cuando el anticuerpo involucrado es de tipo IgM o cuando se trata de anticuerpos del sistema AB0 causantes de enfermedad hemolítica perinatal. El resultado final de la identificación de anticuerpos lo tenemos en 2 horas +/- 20 minutos. [8]

5. ¿Qué es absorción?

La adsorción es un proceso en el cual se utilizan células con fenotipo conocido para provocar que el anticuerpo correspondiente, se pegue a la superficie del glóbulo rojo. A partir de un proceso de adsorción se pueden separar a nivel de laboratorio dos o más anticuerpos mezclados en un suero. Como primer punto para seleccionar las células a utilizar en la absorción, se deben interpretar las reacciones obtenidas en el panel de identificación y establecer cuáles anticuerpos pueden estar involucrados. Seguidamente se debe buscar células cuyo fenotipo posea sólo uno de los antígenos que se sospecha. Una vez seleccionada la célula, se toma partes iguales de células y plasma y se realiza el proceso de adsorción, bajo las condiciones óptimas del anticuerpo en estudio. La parte final del proceso establece una centrifugación, que sirve para separar los glóbulos rojos sensibilizados del plasma y así obtener los dos anticuerpos separados [3]

6. ¿Cuáles son los falsos positivos y negativos de la PCD?

Falsos positivos: brucelosis, malaria, algunos pacientes con linfoma de Hodgkin, 20% de pacientes con leucemia linfocítica crónica, 33% de pacientes con leucemia mielocítica crónica, púrpura trombocitopénica idiopática con anemia hemolítica, convalecencia de infección por Mycoplasma pneumoniae [4] Contaminación bacteriana de las muestras o reactivos, exceso de centrifugación y reticulocitosis [2]

Falsos negativos: Efecto prozona, Ac de baja afinidad, Ac presente tipo IgM o IgA, eritrocitos viejos que no permiten una adecuada reacción Ag-Ac, contaminación de las muestras con proteínas. [2]

7. Como se deben interpretar los resultados de una PCD

Se debe leer como positivos los tubos que presenten aglutinación definiendo así la característica del anticuerpo que esta sensibilizando los GR y se interpretaría de la siguiente manera:

IgG	C3d	Tipo de Acs	Realizar
+	+	IgG fija complemento	Eluado
+	-	IgG No fija complemento	Eluado
-	+	IgM fija complemento	No Eluado

ELUADO: Desprender del estroma del GR los anticuerpos que lo están sensibilizando[5]

8. ¿Cuáles Ag Asociados a enfermedad hemolítica del RN? [6]

9. ¿Que son Igs intravenosas IgIV?

Las IgIV se obtienen por fraccionamiento del plasma de donantes sanos mediante el método de Cohn modificado que contienen un 95% de IgG y cantidades menores de IgA, IgM, IgD, IgE, proteínas y susrancias vasoactivas que tienen a formar agregados moleculares y que son de utilidad terapéutica en pacientes con enfermedades neurológicas y autoinmunes. [7]

10. ¿Cual es el Ag P?

Globosido poco frecuentes en todas las poblaciones, produce la formación de Ac de naturaleza IgM e IgG naturales y regulares contra los antígenos de alta incidencia faltantes. Este es el principal receptor de parvovirus B-19. Dentro del sistema del sistema P encontramos el P1, Pk, P, y el NOR.

BIBLIOGRAFIA

1. Muñiz, D E; Mitos y verdades acerca de la prueba directa de la antiglobulina Rev.Medicina Transfusional al Día. España Vol 12 N1 2014; Pag 32-38

2. Slide Share. Seminario de pruebas de Coombs. [Internet] [Consultado: 7 de Diciembre de 2017] Disponible en: https://es.slideshare.net/rapboy/seminario-de-prueba-de-coombs

3. Alvarado J; Cordero C; Gómez M; Rodríguez A Manual de laboratorio de Banco de Sangre 2016. [Internet] [Consultado el 7 de diciembre de 2017]. Disponible en https://bancodesangreucr.files.wordpress.com/2016/08/folleto-de-banco-de-sangre-20142.pdf

4. Prueba de coombs. [Internet][Consultado el 7 de diciembre de 2017] Disponible en https://www.infobioquimica.com/wrapper/CDInterpretacion/te/bc/327.htm

5. Guía DETERMINACIÓN DE LA ANTIGLOBULINA DIRECTA O COOMBS DIRECTO.

6. Baptista H; Hernández J; Galindo P; Santamaría C; Rosenfeld F. Utilidad de la prueba directa de Coombs en el tamiz neonatal. Rev Bol Med Hosp Infant Mexico 2009. Pag 502-510 [Internet] [Consultado el 7 de diciembre de 2017] Disponible en: http://www.scielo.org.mx/pdf/bmim/v66n6/v66n6a4.pdf

7. Vallejo M S; Manzano C; López I; Mangues J F; Marín M P; Sacristán de Lama R; Millán R. IMMUNO-GLOBULINS ADMINISTERED INTRAVENOUSLY. UPDATING THE INSTRUCTIONS FOR USE. Rev. Farm Hosp 1999; 23(5) Pag. 271-288.

8. Bautista, J; Arevalo C; Castilo R. Taller de inmunohematología. Asociadipon Mexica de Medicina Transfusional Rev Mex Med Tran, Año 7, Núm. 1 2014 Pag 16-24. [Internet][Consultado el 7 de diciembre de 2017] Disponible en: http://www.medigraphic.com/pdfs/transfusional/mt-2014/mt141d.pdf

9. Manual Técnico de la AABB. Ed. aabb17º Edición. 2012

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